Göttinger Lebend Test für BSE Risiko

Name und Anwendungszweck

Der Göttinger Lebend Test für BSE Risiko (GLT) ist ein genetischer Test für die in vitro Detektion von Reaktionseigenschaften von aus bovinem Serum isolierten cirkulierenden Nukleinsäuren (CNA). Dieser Test ist zur Durchführung in professionellen Laboratorien ausgelegt und dient als Surrogat Marker bei lebenden Rindern zur Ermittlung des Risikos BSE zu entwickeln. Rinder die wiederholt eine positive Reaktion in diesem Test zeigen sollten engmaschig kontrolliert werden, da sie ein im Vergleich zur Population erhöhtes Risiko aufweisen.

Zusammenfassung des Tests

Die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) ist eine progressive neurodegenerative Erkrankung bei Rindern. Das Gelangen von Material BSE positiver Rinder in Nahrungsmittel stellt nach heutigen Erkenntnissen ein Risiko für den Menschen dar. Die zurzeit angewendeten Tests für BSE können nur nach Tötung der Tiere durchgeführt werden (post mortem) und sind daher für die Merzung der Erkrankung aus lebenden Herden unbrauchbar. Der Göttinger Lebend Test für BSE Risiko ist ein Lebendtest (ante mortem) zur Erkennung abnormaler CNA Profile bei Rindern. Abnormale CNA Profile sind Ausdruck einer Reaktion des Individuums auf Exposition mit körperfremden Agentien, wie z.B. Toxinen. Die bisher erhobenen Daten deuten darauf hin, dass Rinder mit durch den GLT erfassten Abweichungen ihres Serum-Nukleinsäuren (CNA) Profils ein signifikant erhöhtes Risiko haben, an BSE zu erkranken.

Wegen der noch nicht vollständig aufgeklärten Pathogenese der BSE und dem medizinisch anerkannten Risiko der Übertragung auf den Menschen, sollten GLT positive Proben als potenziell infektiös behandelt werden, bis weitere Untersuchungen neue Erkenntnisse erbringen.

Prinzip des GLT

Epidemiologische Ansätze zur Kontrolle einer Erkrankung erfordern robuste Testmethoden, die Individuen mit hohem Risiko identifizieren können. Die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSEs) stellen eine Gruppe von Erkrankungen dar, die durch die Akkumulation eines umgefalteten natürlichen Proteins, dem Prion Protein gekennzeichnet ist. In seiner natürlich vorkommenden normal gefalteten Form hat das Prion Protein (PrP) keinen Krankheitswert, wohingegen die umgefaltete Form die als PrP^res bezeichnet wird mit TSEs assoziiert ist. Der Bestätigungstest für TSEs bestimmt das Vorhandensein von PrP^res im Gehirn post mortem. Da natürliche Antikörper gegen PrP^res kaum gebildet werden, konnte bisher kein Immunoassay gegen solche Antikörper bei lebenden Tieren (ante mortem) entwickelt werden. Ein anderer epidemiologischer ante mortem Ansatz ist die Messung von cirkulierenden Nukleinsäuren (CNA). CNA sind effektive Marker zur Überwachung von Erkrankungen die mit viralen Gensequenzen assoziiert sind.

Chronix Biomedical hat einen CNA Test entwickelt und validiert, der er erlaubt, das BSE Erkrankungsrisiko in lebenden Herden abzuschätzen. Der GLT basiert auf den gleichen Prinzipien, wie viele andere Tests zur Überwachung von viralen Erkrankungen. Es werden Nukleinsäureveränderungen in der humuralen Fraktion des Blutes (Serum oder Plasma) bestimmt. Diese Nukleinsäuresequenzen sind teilweise homolog zu sogenannten repetitiven Sequenzen in “flanking regions”, die in vielen Genen – auch dem PrP Gen - zu finden sind. Die CNA werden aus dem Plasma oder Serum extrahiert und amplifiziert. Die Signalstärke wird mit der von normalen Kontrollproben verglichen. Proben die wiederholt mehr als fünf Standardabweichungen über den Normalkontrollen liegen werden als reaktiv eingeordnet.

Kurzprotokoll

Probengewinnung und Präanalytik

Serum

1. Blut aus der Schwanzvene oder Schwanzarterie in ein gekennzeichnetes Serumabnahmegefäß entnehmen.

2. Das Blut anschließend 20-30 Minuten gerinnen lassen.

3. Danach gekühlt bei 2-8°C lagern bis zur Zentrifugation.

4. Das Blut muss innerhalb von 24 Stunden zentrifugiert werden.

5. Die Zentrifugation soll bei 1000 x g für 15 Minuten erfolgen.

6. Das Serum wird durch Pipettierung entnommen und je 0,5 mL in mindestens 2 sterile, gekennzeichnete 1,5 mL z.B. Eppendorfröhrchen überführt.

7. Bis zur weiteren Verwendung muss das Serum bei mindestens -20°C gefroren werden.

Plasma

1. Blut aus der Schwanzvene oder Schwanzarterie in ein gekennzeichnetes Abnahmegefäß (EDTA oder Citrat) entnehmen.

2. Danach gekühlt bei 2-8°C lagern bis zur Zentrifugation

3. Das Blut muss innerhalb von 24 Stunden zentrifugiert werden.

4. Die Zentrifugation soll bei 1000 x g für 15 Minuten erfolgen.

5. Das Plasma wird durch Pipettierung entnommen und je 0,5 mL in mindestens 2 sterile, gekennzeichnete 1,5 mL z.B. Eppendorfröhrchen überführt

6. Bis zur weiteren Verwendung muss das Plasma bei mindestens -20°C gefroren werden

Testdurchführung

1. Auftauen der Serumprobe

2. Zentrifugation zur Anreicherung der Mikrovesikel

3. Extraktion der SNA
(Extrahierte Nukleinsäuren können bis zur Verwendung bei -80°C eingefroren werden)

4. PCR mit geeignetem dsDNA Farbstoff durchführen

5. Aufnehmen der Schmelzkurven im diagnostischen Temperaturfenster.

6. Berechnung des Ergebnisses anhand der AUC

Interpretation der Ergebnisse

Nicht Reaktive Proben

· Eine Probe ist nicht reaktiv, wenn das Signal die 5SD Grenze der Normalkontrollen nicht übersteigt.

· Eine nicht reaktive Probe wird als im Vergleich zu Normalen als unauffällig betrachtet. (zeigt das gleiche CNA Profil wie die gesunden Vergleichsproben

· Rinder mit nicht reaktiven CNA zeigen kein messbar erhöhtes BSE Risiko zum Zeitpunkt der Probengewinnung.

Reaktive Proben

· Eine Probe wird als reaktiv betrachtet, wenn zwei Aliquots ein messbar über der 5SD Grenze liegendes Ergebnis zeigen.

· Rinder mit wiederholt reaktivem Ergebnis werden als Tiere mit erhöhtem BSE Risko eingestuft.

Test Ergebnisse der bisherigen Studien:

Untersuchungen an BSE Kohorten:

Die EU definiert Kohorten als Tiere, die innerhalb von 12 Monaten um die Geburt eines BSE erkrankten Tieres auf demselben Hof geboren wurden oder aufgewachsen sind. Statistisch haben solche Tiere, nach den Erhebungen des BMVEL ein ca. 100-fach erhöhtes Risiko an BSE erkrankt zu sein als die Gesamtpopulation. Dieses Risiko begründet sich auf die Tatsache, dass alle Tiere einer Kohorte, dem gleichen BSE-kontaminierten Futter ausgesetzt worden sind, wie das an BSE erkrankte Rind

Tabelle 1 zeigt, dass die Wahrscheinlichkeit PrP^res positiv an BSE erkrankt zu sein in Kohorten über 100-fach höher ist als in normal geschlachteten Rindern die nicht von Kohorten stammen

Um zu untersuchen, ob dieses mehr als 100-fach erhöhte BSE Risiko mit Veränderungen im GLT einhergeht wurden fünfzehn individuelle BSE Kohorten untersucht. Aus den Ergebnissen (Figure 1) wird erkenntlich, dass mindestens 33% der Rinder in einer Kohorte ein positives GLT Ergebnis zeigen. Zusätzlich zeigten

vier von vier getesteten PrP^res positiven BSE Rindern ein positives GLT Ergebnis. Die Ergebnisse sind im Vergleich zu normal geschlachteten Kontrollrindern hoch signifikant (p<0.001).

Normalkollektiv

908 Serumproben von bestätigt PrP^res –negativen Rindern wurden in einem Schlachthaus entnommen und wie oben beschrieben im GLT getestet. Tabelle 2 zeigt die Anzahl der getesteten Tiere und die Rate positiver Ergebnisse. Alle eingeschlossenen Rinder sind mit einem zugelassenen Schnelltest auf PrP^res im Hirnstamm untersucht worden und waren negativ. In jedem Testlauf wurden Extraktionskontrollen, Amplifikations–kontrollen, negative Kontrollseren und Leerkontrollen mitgeführt. Zusätzlich wurde ein Panel von bekannten Kohortenproben vermessen (23 positive und 12 negative). Die Proben wurden

Tabelle 2
Test Population	N	RR	%RR
Schlachthaus Rinder	908	5	0.55
Kohorten Kontrollen	35	23	65.7

verblindet im GLT getestet, die Ergebnisse ermittelt und am Ende eines jeden Testtages entblindet. Ergebnisse wurden akzeptiert, wenn die Kontrollen richtig erfasst wurden. Die Ergebnisse dieser Studie sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Überblick der Ergebnisse

Die bisherigen Studien wurden an 908 normalen, PrP^res negativen Rindern, 4 bestätigten BSE Rindern und 207 Hoch-Risiko Kohorten Rindern durchgeführt.

Die Gesamtergebnisse (Figure 2) zeigen, dass BSE Kohorten eine ca. 100-fach höhere GLT Reaktivität haben als normal geschlachtete nicht an BSE erkrankte Rinder.

Schlussfolgerung

Die Ergebnisse der Studien mit dem GLT, wie sie in Figure 2 gezeigt sind, erlauben den Schluss, dass:

1. 65% von Hoch-Risiko BSE Kohorten Rindern (n=207) und vier von 4 BSE Rindern (100%) ein wiederholt reaktives Ergebnis zeigen.

2. nur 0.55% von gesund geschlachteten, PrP^res negativen Rindern (n=908) in Deutschland eine GLT Reaktivität zeigen.

Rinder, die eine wiederholt positive Reaktion im GLT zeigen, sollten als Tiere betrachtet werden, die ein erhöhtes Risiko einer bereits stattgefundenen PrP^resExposition aufweisen und somit ein erhöhtes Risiko BSE zu entwickeln in sich tragen.

Anmerkungen

Die hier gezeigten Studien wurden im Tierärztlichen Institut der Universität Göttingen unter der Leitung von Prof. Dr. Dr. Bertram Brenig durchgeführt.

Der GLT Test ist kein zugelassener Test zur Diagnostik von BSE. Der Anwendungszweck ist vielmehr für epidemiologische Untersuchungen im Sinne einer Risikoabschätzung.

Die gezeigten Daten sind zurzeit in Begutachtung zur Publikation in wissenschaftlichen Zeitschriften eingereicht.

Material und Methoden

Serum Proben. Blut wurde aus der Schwanzvene oder der Schwanzarterie von Rindern in 18 mL Kunststoffröhrchen, die mit Gerinnungsaktivatoren beschichtet waren entnommen. Diese wurden für 30 min. bei Raumtemperatur bis zum Eintritt der Gerinnung und danach bei 4 bis 8ºC gelagert. Die Zentrifugation erfolgte innerhalb von 24 Stunden bei 1000 x g für 15 min. Der Serumüberstand wurde sofort in 1.5mL Röhrchen überführt und eingefroren (bei –20 °C oder -80 °C).

Plasma Proben. Analog der Serum Entnahme kann eine Plasma Gewinnung in EDTA oder Citrat antikoagulierter Form erfolgen. Heparinat-Röhrchen sind ungeeignet. Die weitere Verarbeitung ist wie unter “Serum” beschrieben, wobei eine 30 minütige Aufbewahrung des Blutes bei Raumtemperatur entfallen kann.

Proben Präparation. Eingefrorene Seren wurden bei 4ºC aufgetaut. 250 µl wurden bei 20,000 x g für 30 min. bei 4 °C in einer Modell 5214 Zentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Germany) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet für die weitere Verarbeitung verwendet.

Nukleinsäure Extraktion. 20,000 x g Pellets wurden mit einem Standardverfahren zur Extraktion nach Vorschrift des Herstellers verwendet (NucleoMag; Macherey & Nagel, Düren, Germany). Die Nukleinsäure Extrakte wurden bei -80ºC bis zur weiteren Verwendung eingefroren.

Diagnostische PCR. Drei µL der wie oben beschrieben extrahierten CNA wurden in einer PCR mit einem Gesamtvolumen von 20µL verwendet. Die Primer CHX-1F and CHX-1R (Cat#: 42-4103 und 42-91102, Chronix Biomedical GmbH, Göttingen, Germany), wurden mit 1 µM in einem “proofreading” Polymerase System (Advantage-2 PCR Kit, BD-Clontech, Heidelberg, Germany) eingesetzt. Nach 30 Zyklen (95 °C für 30 sec, 55 °C für 45 sec, 68 °C für 1 min) wurde mit Hilfe von SybrGreenI (Cat#: S7563, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) eine Schmelzkurve in einem MX4000 PCR System aufgenommen (Cat#: 401260, Stratagene, La Jolla, CA, USA). Die Fläche unter der Kurve (area under the curve; AUC) der abgeleiteten Fluoreszenzfunktion –d(F)/dT zwischen 87 °C und 90 °C wurde zur Analyse herangezogen. Die Reaktivität jeder individuellen Probe wurde auf der Basis der mit 5SD definierten unteren Messgrenze ermittelt.

Statistik. Die statistische Signifikanz der Differenz in der Reaktivität zwischen normalen Rindern und Kohortentieren wurde mittels des Chi²-Tests ermittelt. Die Anzahl der Freiheitsgrade wurde der Anzahl der getesteten Gruppen jeweils angepasst.

Literatur

1. Taback, B. and D. S. Hoon. Circulating nucleic acids in plasma and serum: past, present and future. Curr Opin Mol Ther. 6(3):273-278, 2004.

2. Durie, B.G.M., H.B. Urnovitz and W.H. Murphy. RNA in the Plasma of Multiple Myeloma Patients: Clinical Relevance and Molecular Pathology. Acta Oncologica. 39: 789-796, 2000.

3. Urnovitz, H.B., J.J. Tuite, J.M. Higashida and W.H. Murphy. RNA in the Serum of Persian Gulf War Veterans Has Segments Homologous to Chromosome 22q11.2. Clin Diag Lab Immunol. 6:330-335, 1999.

4. Brenig B, E. Schütz, und H.B. Urnovitz. Zelluläre Nukleinsäuren in Serum und Plasma als neue Diagnostische Werkzeuge. Berl. Münch. Tierärztl. Wochenschr. 115: 122-4, 2002

5. BMVEL [Zahl der durchgeführten BSE-Tests im Berichtszeitraum] (2003).